再生醫學的治療新策略
摘要： 外泌體源自內吞膜，是納米級的囊泡，含有核酸、蛋白質、脂質等生物分子，是原核生物和真核生物中細胞間通訊的有效載體，參與了多種病理生理過程的調節。 當前研究發現，幹細胞來源的外泌體具有促進細胞增殖、遷移、免疫調節等多種功能，可作為無細胞治療劑應用於再生醫學領域，包括急慢性腎損傷、缺血–再灌注損傷，肝臟、皮膚、角膜損傷等。 本綜述主要聚焦外泌體的促增殖作用，概述其未來可能的應用方向。
細胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）是細胞以胞吞、胞吐等方式釋放的膜性囊泡，其發現可以追溯到1940年代，最初由Chargaff和West於1946年報導 [1]，廣泛存在於原核生物、真核生物。 這些EV中含有脂質、蛋白、RNA、DNA，可通過體液運輸到遠隔部位，發揮細胞間通訊的作用，影響靶細胞的代謝、增殖。 根據EVs釋放機制及大小可分為三類：1） 細胞凋亡過程中由膜起泡形成的大於1000 nm的凋亡小體; 2） 由細胞出芽形成的100~1000 nm的微囊泡; 3） 多泡體與質膜融合后釋放的小於150 nm的外泌體[2].
近年來，幹細胞療法因其多能性、自我更新和促進再生細胞因數分泌的能力而蓬勃發展 [3]，多項研究已經提出幹細胞的治療作用主要是通過分泌可溶性因數以旁分泌的作用形式介導的，其中在幹細胞的部分分泌組中，外泌體在旁分泌作用中起主要作用 [4]。 外泌體穩定、易於儲存，可以通過過濾滅菌並作為現成產品生產，且無免疫排斥，具有歸巢效應 [5]，劑量易於控制，避免了幹細胞的許多缺點，因此，事實上，間充質幹細胞（mesenchymal stem cell， MSC）外泌體已被用作MSCs的替代品，用於各種疾病模型中的無細胞治療新策略，包括神經、心血管、免疫、腎臟、 肌肉骨骼、肝臟、呼吸、眼科、皮膚病以及癌症 [6] - [12]。
（一） 生物發生和釋放
外泌體的生物發生和釋放機制如下：1） 吞噬體與質膜產生的早期內體經歷一系列成熟步驟形成晚期內體，即多泡體（Multivesicular Bodies， MVB），在此過程中，腔內囊泡（intraluminal vesicles， ILVs）積聚在其管腔，而貨物分揀到ILVs是由內體分選複合物（endosomal sorting complex required for transport， ESCRT）依賴和ESCRT獨立機制所需的內體分揀複合物介導的 [13]; 2） 內體衍生的MVB部分進入溶酶體被降解，部分與細胞膜融合; 3） MVB通過胞吐作用釋放外泌體，進入細胞外環境 [14]。 此外，有研究表明，外泌體也可由質膜直接出芽釋放或通過在細胞內質膜連接隔室（intracellular plasma membrane-connected compartments， IPMCs）出芽延遲釋放 [15]，在後者的情形中，這些IPMCs通過頸部與細胞外環境相連接，其中囊泡可以以脈衝形式儲存和釋放 [16]。
MVB的運輸與細胞膜的融合受到Rab鳥苷三磷酸酶（GTPase）蛋白如Rab27、Rab11、Rab2B、Rab5A、Rab9A、Rab27A、Rab27B的調節 [17]，同時與細胞骨架的運動相協調。 最近的研究發現，肌動蛋白細胞骨架調節蛋白cortactin在調節外泌體分泌中起重要作用。 研究發現cortactin、Rab27a和coronin 1b協同控制多泡晚期內體中皮質肌動蛋白對接位點的穩定性，從而促進外泌體分泌 [18]。 此外，液泡蛋白分選因數4 （vacuolar protein sorting 4， Vps4）和轉運所需的ESCRT與泛素化蛋白的結合可促進外泌體的釋放，小GTPase的Ral家族也對外泌體的生物發生起到調節作用。 紫外線輻射、氧自由基刺激、鈣水準或膽固醇含量的變化都可能導致外泌體分泌的變化 [15]。
（二） 組成
外泌體包含許多分子，包括蛋白質、脂質、代謝物、mRNA、線粒體DNA、miRNA和許多其他非編碼RNA等。 目前，已證實外泌體可從各種細胞中分泌，包括B細胞 [19]、T細胞 [20]、樹突細胞 [21]、血小板 [22]、施萬細胞 [23]、腫瘤細胞 [24]、心肌細胞 [25]、內皮細胞 [ 26]、幹細胞 [27] 等。 外泌體的大小和貨物是異質的，即使來自同一個細胞也是如此。 但在不同的外泌體中，存在部分共同的貨物。
外泌體中含有豐富的四跨膜蛋白，如CD9、CD81、CD82、CD37和CD63 [28]，這些蛋白質對細胞靶向和黏附至關重要。 此外，Rab GTPase、膜聯蛋白和筏蛋白對膜融合很重要，熱休克蛋白（heat shock protein， HSP） 70和HSP90是分子伴侶，腫瘤易感基因101 （tumor susceptibility gene， TSG101）蛋白參與MVB生物發生。 外泌體還含有細胞因數、轉錄因數受體、生長因數受體和其他生物活性分子 [13]。
外泌體中存在microRNA、核糖體RNA和長鏈非編碼RNA，這些mRNA以主動的方式被分選到外泌體。 一個被廣泛接受的假設是，microRNA可以通過外泌體直接遞送至靶細胞，從而對其mRNA靶標進行功能調節。 然而仍缺乏對細胞外囊泡介導的miRNA轉移功能的直接證明 [29]。 據報導，EV中富集了3'UTR mRNA片段，而不是完整的mRNA分子。 由於3'UTR包含多個調節miRNA結合位點，這表明EV的RNA可能與細胞RNA競爭結合受體細胞中的miRNA或RNA結合蛋白，從而調節穩定性和翻譯 [30]。 含有mRNA的EV也已被證明可以在各種壓力條件下增強細胞存活能力和組織修復，研究發現人間充質幹細胞衍生的EV含有239個mRNA，其中大部分參與細胞分化、轉錄、細胞增殖和免疫調節 [31]。 同時，其mRNA含量受細胞生理狀態和應激條件的調節，可能在維持組織穩態和同步細胞功能狀態中發揮作用 [32]。
（三） 作用機制
EV主要通過調節細胞內的信號通路來促進細胞增殖和減少細胞凋亡，其治療作用主要由治療性蛋白質與miRNA介導。
1） 基於蛋白質的作用機制
Zhang等人 [33] 研究發現，在大鼠皮膚燒傷模型中，EV攜帶的Wnt4促進β-catenin核轉位和活性以增強皮膚細胞的增殖和遷移。 Katsuda等人 [34] 發現，脂肪組織來源的間充質幹細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells， ADSC）衍生的EV含有酶活性中性溶酶（也稱為CD10），是大腦中的限速澱粉樣蛋白β （Aβ）降解酶，共培養實驗中， ADSC-EV被轉移到過表達澱粉樣前體蛋白的Neuro-2a細胞中，從而降低了細胞外和細胞內的Aβ水準。 另一項研究 [35] 也發現，骨髓（bone marrow， BM）-MSC衍生的EV攜帶具有酶功能的CD73 （也稱為ecto-5'-核苷酸酶），可將AMP代謝為腺苷，通過一系列信號傳導，表達A2AR的1型輔助T （Th1）細胞會導致細胞凋亡。
2） 基於RNA的作用機制
miRNA也被認為是介導MSC-EV治療潛力的關鍵分子。 MSC衍生的外泌體miRNA不僅可以減少受損神經細胞的凋亡，還可以通過改善神經可塑性來增強大腦功能 [36] [37]。 不同的作者已經報導了不同的外泌體miRNA，如miR-22、miR-19a、miR-223和miR-132發揮心臟保護作用，他們提出了各種相關基因和信號通路作為機制解釋 [38]。
外泌體參與免疫調節、神經細胞之間的信號傳遞、生殖與發育、腫瘤、神經退行性疾病、感染等多種生理、病理過程 [13]。 其中，具有與增強細胞增殖有關的功能的外泌體大多來源於幹細胞 [39]，其功能主要由miRNA介導。 因此，外泌體可以充當幹細胞的替代介質。
下面主要討論幹細胞衍生外泌體在不同疾病中的促增殖與再生作用。
（一） 腎臟疾病
外泌體對於急性腎損傷（AKI）、腎移植的調理、慢性腎臟病（CKD）均有一定功效。
一些臨床前研究表明，幹細胞衍生的EV在不同的AKI模型中具有促進組織修復和減少炎症的功能，這在其他綜述中已有總結。 AKI的標誌是腎功能迅速下降，同時腎小管細胞丟失，導致血尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）和血漿肌酐升高，2009年，布魯諾等人 [31] 證明，在甘油注射誘導的AKI模型中，BMMSC-EVs加速受損腎小管細胞的恢復，促進細胞增殖並保護細胞免於凋亡，BM MSC-EV攜帶特定的mRNA， 進而刺激受體受損細胞重新進入細胞週期。
對於腎移植患者，用間充質幹細胞（MSC）和MSC-EV對腎臟進行預處理可限制由於缺血再灌注損傷和慢性同種異體移植腎病引起的組織損傷 [40]。 MSCs和MSC-EVs在心臟死亡后器官捐獻（Donation after Cardiac Death， DCD）的腎臟的大鼠模型中進行了測試。 在器官冷灌注（4小時）期間用MSC-EV處理的DCD腎臟顯示出顯著降低的腎損傷跡象 [41]。
終末期CKD患者腎功能不全的主要原因為腎小球、腎小管纖維化。 最近，從BM MSCs和肝臟MSCs分離的EV已被證明在已經建立的糖尿病腎病模型中可有效逆轉腎纖維化 [42]。 MSC-EV和HLSC-EV包含一系列能夠下調促纖維化基因、恢復正常腎功能的抗纖維化miRNA。
目前，Nassar等人 [10] 發表了他們使用臍帶組織MSC衍生的EV來改善CKD進展的II/III期臨床試驗結果，在該研究中，20名被診斷患有CKD （eGFR 15~60 mg/ml）超過6個月的患者接受了兩劑（間隔1周） MSC-EV （100 μg/kg/劑）的治療。 1年後患者表現出eGFR和尿白蛋白肌酐比值的改善，以及BUN和肌酐的顯著降低，同時血漿中TGF-β和IL-10水準顯著升高，而TNF-α持續顯著降低。
（二） 肝臟疾病
MSCs可改善肝硬化患者的疾病進展，而MSC來源的外泌體具有類似的效果。 Li等人 [43] 在昆明小鼠中使用四氯化碳（CCl44）誘導的肝損傷模型。 發現源自人臍帶間充質幹細胞的外泌體通過抑制肝細胞的上皮–間質轉化和膠原蛋白的產生來改善肝纖維化。 另外，研究 [44] 表明，來自接受免疫抑制治療或經過修飾以表達免疫抑制細胞因數的小鼠的DC衍生外泌體促進耐受性免疫反應，mRNA-155和miRNA-125b富集的外泌體促進M1的分化巨噬細胞超過M2巨噬細胞，從而改善小鼠的炎症反應。 人羊膜上皮細胞衍生的外泌體顯著減少肝纖維化期間巨噬細胞的數量和巨噬細胞浸潤 [45]。 肝細胞來源的外泌體可以轉移鞘氨醇激酶2，在靶肝細胞中形成1-磷酸鞘氨醇，從而引起細胞增殖和肝臟再生 [46]。
迄今為止，只有少數幾組研究了MSC外泌體在急性肝損傷中的治療作用。 一些研究表明，MSC-EVs可以抑制促炎性巨噬細胞的增殖和活化，進而減少白細胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因數-α （tumor necrosis factor α， TNF-α）等細胞因子的分泌，從而顯著改善急性肝衰竭（acute liver failure， ALF）， 該機制可能與MSC-EV抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 （NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）通路有關 [47] [48] [49]。 Lou等人 [8] 發現，脂肪組織來源的MSCs可以顯著降低升高的血清丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶水準，及血清促炎因子水準。 因此，有理由相信，MSC衍生的外泌體的移植可能是一種治療各種類型急性肝損傷的新治療方法。
（三） 心血管疾病
外泌體對心臟的有益作用包括抗凋亡、抗炎、抗心臟重塑、心臟再生 [50]。 外泌體中的miR-22和miR-221分別靶向甲基CpG結合蛋白2 （Mecp2） [51] 和PUMA [52] （Bcl-2蛋白家族的一個亞類），降低其表達，從而發揮抗凋亡作用，改善心肌梗死區域的心肌細胞丟失。 將MSC外泌體直接注射到心肌梗塞的邊界區域可減少動物模型中的纖維化和炎症。 對靶基因和通路的分析表明，PI3k-Akt-mTOR通路可能是造成這些現象的主要機制，因為miR-29、miR-24表達上調，而miR-34、miR-130，miR-378表達 [53]。 miR-24的上調限制了主動脈血管炎症。 重要的是，miR-24在小鼠心肌梗死模型中的體內表達可抑制心肌細胞凋亡、縮小梗死面積並減少心源性死亡 [54]。 心肌祖細胞（cardiac progenitor cell， CPC）來源的外泌體可促進內皮細胞遷移、血管內皮生長因數分泌 [55] 來誘導心臟再生並改善心臟功能。
外泌體還可促進新生血管的形成，這與內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖、遷移、分化有關 [50]。 同時，MSCs衍生的外泌體最近已被證明可上調wnt5a，通過穩定細胞連接處的紐蛋白以幫助細胞一起移動，在內皮細胞遷移中發揮重要作用，從而增強血管形成與遷移能力 [56]。
（四） 皮膚再生
脂肪幹細胞來源的外泌體（ADSCs-EXOs）富含miRNA-125a和miRNA-31，可轉移至血管內皮細胞以刺激增殖和促進血管生成 [57] [58]。 在皮膚癒合的增殖期，成纖維細胞增殖產生細胞外基質（extracellular matrix， ECM），而上皮細胞增殖並向傷口中心遷移以促進傷口癒合。 因此，皮膚細胞的增殖和再上皮化對皮膚再生很重要。 ADSCs-EXO被成纖維細胞內化，並以劑量依賴性方式刺激增殖、遷移和膠原合成 [59]。 最後，ADSCs-EXOs可以通過調節成纖維細胞分化和基因表達來刺激細胞外基質的重建，從而促進傷口癒合和防止瘢痕增殖。 王等人 [60] 發現ADSCs-EXOs阻止了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，但增加了體內轉化生長因數-β3 （transforming growth factor-β3， TGF-β3）與TGF-β1的比率，同時增加了皮膚真皮成纖維細胞中基質金屬蛋白酶-3 （matrix metalloproteinase 3， MMP3）的表達，導致MMP3與基質金屬蛋白酶-1組織抑製劑（TIMP1）的比例很高，有利於細胞外基質（ECM）的重塑，減少疤痕。
（五） 角膜再生
角膜覆蓋眼球總表面的前1/6，表面為非角化複層鱗狀上皮，神經支配豐富。 角膜的其他細胞成分是角膜基質細胞和內皮細胞。 角膜損傷觸發修復途徑，癒合過程中的瘢痕形成會損害角膜的透明度，並可能致盲 [61]。
角膜內皮營養不良是導致視力喪失和角膜移植的原因之一，Buono等人 [62] 研究發現，在角膜營養不良體外模型中，MSC-EV能夠誘導人角膜內皮細胞中大部分內質網應激相關基因的顯著下調。 同時，它們上調了Akt通路並限制了caspase-3的激活和細胞凋亡。 Shang [63] 等人發現，用脂肪間充質幹細胞衍生的外泌體處理兔角膜基質細胞可使細胞增殖增加、細胞凋亡減少，同時細胞外基質沉積，證明外泌體可能為角膜再生的重要介質。
Han等人 [64] 已經證明，上皮衍生的外泌體介導角膜上皮細胞、角膜基質細胞和血管內皮細胞之間的通訊。 此外，角膜緣基質細胞衍生的外泌體有助於角膜緣上皮細胞（limbal epithelial cell， LEC）的增殖和傷口癒合 [65]，人角膜間充質基質細胞（corneal mesenchymal stem cell， cMSC）外泌體也可加速角膜上皮傷口癒合。 Shojaati等人 [66] 的研究證明，在角膜清創小鼠模型中，來自角膜基質幹細胞的EV可以減少炎症、瘢痕和纖維化，從而提高角膜透明度。
Samaeekia等人的研究表明，角膜間充質幹細胞衍生的外泌體可以增加角膜損傷的傷口癒合 [67] 在損傷的角膜中，外泌體上調抗血管生成因數的表達，如血小板反應蛋白1 （thrombospondin 1， TSP-1）和抗炎細胞因數，包括IL-10、TGF-β1和IL-6，同時下調促炎因數的表達，如IL-2、干擾素-γ （interferon-γ， IFN-γ）、巨噬細胞炎症蛋白-1α和血管內皮生長因數（vascular endothelial growth factor， VEGF） [68]。 Leszczynska等人研究發現，角膜緣角質細胞衍生的外泌體啟動Akt信號傳導並促進角膜緣上皮細胞的傷口癒合 [65]。 目前，使用EV治療眼部疾病仍處於臨床前實驗階段。
（六） 神經系統疾病
外泌體對於神經系統疾病具有潛在的治療效果。 Xin [69] 等人研究發現，富含miR-133b的星形膠質細胞來源的外泌體中的氧–葡萄糖消耗（OGD）介導中風后神經元的生長和伸長。 星形膠質細胞來源的外泌體也轉運miR-190b以防止OGD誘導的自噬和抑制神經元凋亡 [70]。 同時，MSC外泌體中包含的miR-17-92簇可介導信號通路PI3K/Akt/mTOR的激活，導致腦卒中啮齒動物模型中的神經元重塑和神經發生 [71]。
一項研究 [72] 表明，暴露於β-澱粉樣蛋白的星形膠質細胞衍生的外泌體中存在過量的阿爾茲海默症（AD）的生物標誌物磷酸化Tau蛋白。 另一項研究 [73] 表明，根據動物實驗，釋放到血清中的β-澱粉樣蛋白和tau最有可能來自大腦中星形膠質細胞衍生的外泌體。 星形膠質細胞衍生的EV在AD患者中的強大作用也可以顯示星形膠質細胞衍生的EV在腦靶向治療中有較好的開發前景 [74]。
外泌體通過運輸核酸、蛋白質、脂質在細胞間通訊發揮重要的作用，參與多種生理、病理過程，其主要功能可能與由傳遞的RNA介導。 儘管自外泌體發現以來，人們就對外泌體研究產生了濃厚的興趣，然而，對於外泌體形成、蛋白質與RNA的分選、貨物的釋放等機制仍不清楚。 但是，其促進細胞增殖與再生的治療作用是毋庸置疑的。 未來，外泌體將是心血管、腎臟、肝臟、神經、眼科等疾病的一種較有前景的治療方式。
了解更多關於： 幹細胞外泌體霧化療程
*Corresponding author.
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